¿Qué es el azul de lactofenol?
El azul de lactofenol, o azul de algodón, es un preparado con propiedades de colorante simple. Se utiliza en laboratorios clínicos para colorear principalmente estructuras fúngicas, como hifas, tubos germinativos y esporas.
Ayuda en el diagnóstico presuntivo o preliminar de ciertos hongos, sin embargo, siempre es aconsejable reforzar el diagnóstico con pruebas más específicas, tales como pruebas bioquímicas o serológicas.
El azul de lactofenol se compone de ácido láctico, azul de anilina, glicerina, fenol y agua desionizada. Se puede preparar en el laboratorio o comprarse listo. Una vez preparado está listo para ser usado, y bajo ningún concepto debe diluirse, pues esta acción dará pésimos resultados.
La concentración de sus componentes lo hacen ideal para teñir las estructuras fúngicas, debido a que el fenol elimina la microbiota bacteriana acompañante, mientras que el ácido láctico genera una película protectora alrededor de la estructura fúngica. Finalmente, el azul de anilina tiene afinidad para adherirse a las estructuras del hongo.
Fundamento del azul de lactofenol
Con el azul de lactofenol se realiza una coloración simple de las estructuras fúngicas de un determinado cultivo micológico. Se llama simple porque utiliza un solo colorante.
El azul de lactofenol aparte de teñir, también actúa como clarificante de la muestra, gracias a la acción conjunta del ácido láctico y el fenol. Además, el fenol se comporta como un mordiente y a la vez evita la lisis del microorganismo al inhibir las enzimas hidrolíticas que puedan estar presentes. El ácido láctico preserva la morfología de las estructuras del hongo.
Por otra parte, el azul de anilina tiene la propiedad de adherirse o fijarse a las estructuras que contienen quitina. Las estructuras se tiñen de color azul claro.
Cabe destacar que la pared celular de los microorganismos fúngicos, especialmente los mohos, contienen quitina, siendo por ello que este colorante es ideal para teñir estos microorganismos.
Características del azul de lactofenol
– Composición. Contiene ácido láctico, fenol, glicerol y azul de anilina, o azul de algodón.
– Tinción. Tiñe selectivamente las paredes celulares de los hongos, permitiendo una clara visualización de sus hifas, esporas y otros elementos estructurales. Es especialmente útil para observar hongos filamentosos.
– Propiedades conservantes. El fenol y el ácido láctico presentes en la solución ayudan a conservar las muestras, impidiendo el crecimiento de bacterias u otros microorganismos que podrían interferir con el análisis.
– Gran detalle. El contraste que proporciona el colorante (azul de algodón) resalta las estructuras fúngicas, facilitando su estudio con mayor precisión.
– Empleo. Se utiliza principalmente para identificar hongos patógenos, tanto en investigaciones de laboratorio como en estudios clínicos, veterinarios y agrícolas. Es común en la observación de Aspergillus, Penicillium, Candida, entre otros.
Composición del azul de lactofenol
La fórmula para preparar un litro de azul de lactofenol es la siguiente:
-250 g/L de ácido láctico
-1.0 g/L de azul de anilina o azul de metilo
-500 g/L de glicerina
-250 g/L de fenol
-250 ml de agua desionizada o destilada.
Se disuelve el fenol en el agua previamente entibiada. Se adiciona el ácido láctico y la glicerina, y se mezcla muy bien. Por último, se disuelve el azul de anilina. Se mezcla nuevamente y está listo para su uso.
Las porciones para preparar 80 ml de solución de azul de lactofenol son:
-20 g cristales de fenol.
-20 ml de ácido láctico.
-40 ml de glicerina o glicerol.
-20 ml agua destilada.
Uso del azul de lactofenol
Se utiliza para teñir estructuras fúngicas y, a través de las características morfológicas observadas a nivel microscópico, poder realizar un diagnóstico presuntivo del hongo.
Procedimiento para utilizar el azul de lactofenol
- Coloración de estructuras fúngicas de cultivos
- 1. Se toma un cultivo puro del hongo al cual se le quieren observar sus estructuras.
- 2. Se trabaja preferiblemente en una campana de flujo laminar, o bajo el mechero, utilizando tapaboca y guantes, ya que es necesario cumplir con normas de bioseguridad, porque la mayoría de los mohos son fáciles de diseminar en el ambiente y, por tanto, representan un peligro para el operador.
- 3. En un portaobjeto se coloca una gota de azul de lactofenol.
- 4. Se corta un cuadrito de cinta adhesiva de buena calidad y con mucho cuidado se adhiere en el extremo del asa de platino ya esterilizada y fría.
- 5. Se acerca el asa de platino a la parte más superficial de la colonia fúngica y con mucho cuidado se toca el cultivo, exactamente donde se encuentra la pega de la cinta adhesiva.
- 6. Luego se lleva al portaobjeto y se coloca justo sobre la gota de azul de lactofenol, cuidando que la cinta quede perfectamente extendida y lubricada con el colorante. Con mucha delicadeza se retira el asa de platino.
- 7. Se coloca otra gota de azul de lactofenol sobre la cinta y encima un cubreobjeto. No se debe ejercer demasiada presión para no destruir las estructuras del hongo, ya que estas son extremadamente frágiles. Se debe dejar actuar el colorante por 3 a 4 minutos aproximadamente.
- 8. Luego de este tiempo, ya la preparación está lista para ser observada al microscopio en aumento de 10X o 40X. Si se requiere la observación a 100X se debe utilizar aceite de inmersión.
- 9. Las estructuras del hongo, por lo general, se observan teñidas de color azul, a excepción de los hongos dematiáceos, que conservarán su coloración marrón característica de este tipo de hongos.
- Tinción de muestras biológicas directas. Si se requiere estudiar una muestra biológica directa, como esputos, pus, exudados, secreciones, entre otras, estas necesitan tener un procedimiento previo de descontaminación de la muestra. Se utiliza para ello solución de NaOH.
- Muestras de cabello. Se toman varios cabellos afectados (10 en total) de la/s lesiones presuntivas de tiña capitis (zonas alopécicas) y se colocan sobre un portaobjetos (3 a 4 cabellos por portaobjetos). Encima se coloca unas gotas de azul de lactofenol e inmediatamente se cubre con un cubreobjeto. Tomar el portaobjeto con una pinza y calentar suavemente sobre un mechero. Para ello, hacer 3 a 4 pases rápidos por la llama. Observar al microscopio en 40X y buscar esporas fuera o dentro del cabello (ectothrix o endothrix, respectivamente). Si es necesario, colocar aceite de inmersión y observar en 100X.
- Coloración del tubo germinativo en la identificación de Candida albicans. Después de incubar el cultivo presuntivo de Candida albicans en suero humano durante 2 a 4 horas a 37 °C, se toma una porción de la solución y se tiñe con azul de lactofenol. La preparación se observa al microscopio a 40X. El tubo germinativo, si está presente, y las blastosporas se tiñen de azul brillante.
Ficha de seguridad del azul de lactofenol
La Asociación Nacional de Protección contra el Fuego (NFPA), establece la ficha de seguridad de las sustancias químicas en cuanto al riesgo que esta representa según varios aspectos, estos los simboliza a través de un rombo de colores y un número que va desde 0-4.
El riesgo a la salud se identifica en color azul, la inflamabilidad en color rojo, la inestabilidad o reactividad en color amarillo y algún peligro especial en blanco.
- Salud. El riesgo para la salud que presenta el azul de lactofenol, según la NFPA, es de nivel 3. Esto significa que la sustancia es extremadamente peligrosa cuando es ingerido o se encuentra en contacto directo con piel o mucosas. Es una sustancia altamente corrosiva e irritante. Al contacto con piel y mucosas causa quemaduras graves. Si es ingerida puede causar dolor de cabeza, confusión, letargo, inconsciencia, paro respiratorio e incluso la muerte.
- Inflamabilidad. Según la NFPA, el azul de lactofenol se encuentra clasificado en nivel 1 en cuanto a inflamabilidad. Esto quiere decir que hace combustión solo si se calienta por encima de los 94 °C.
- Inestabilidad. Catalogado según la NFPA en nivel 0 (cero) en cuanto a reactividad. Esto significa que no tiene riesgo de reactividad, es decir, es una sustancia estable químicamente hablando.
- Peligros especiales. No ofrece peligros especiales adicionales.
Referencias
- Azul de Lactofenol. Recuperado de labsar.com.
- Azul de lactofenol. Recuperado de cromakit.es.
- Microscopía Azul de lactofenol en solución. Recuperado de labmerck.com.
- Lactophenol Cotton Blue. Recuperado de himedialabs.com.
- Wanger, A., Chavez, V., Huang, R., Wahed, A., Actor, J., Dasgupta, A. Biochemical Tests and Staining Techniques for Microbial Identification. Recuperado de sciencedirect.com.