Bromuro de etidio

¿Qué es el bromuro de etidio?

El bromuro de etidio es un compuesto fluorescente y aromático que tiene la capacidad, debido a su estructura química, de intercalarse entre las cadenas del ADN. Asimismo, se une a las moléculas de ARN altamente plegadas. Esto permite que haya una interacción entre esta sal y las bases nitrogenadas.

El bromuro de etidio absorbe la luz ultravioleta en una gama de longitudes de ondas comprendidas entre 210 nm y 285 nm, emitiendo una fluorescencia anaranjada de 605 nm. La intensidad de su fluorescencia aumenta hasta 20 veces cuando interacciona con el ADN.

Debido a su propiedad de fluorescencia, el bromuro de etidio se utiliza para visualizar los fragmentos de ADN separados mediante electroforesis en agarosa (imagen superior); técnica introducida en forma independiente por Aaij y Borst (1972) y Sharp (1973).

El bromuro de etidio al intercalarse entre las cadenas del ADN, podría obstaculizar además sus procesos de duplicación y transcripción; y por lo tanto, ser causa de la generación de mutaciones. Sin embargo, no existen evidencias concluyentes que comprueben esta suposición.

Estructura química del bromuro de etidio

En la imagen superior tenemos la estructura molecular del bromuro de etidio representada por su fórmula estructural.

La molécula es casi totalmente plana, debido a que todos los átomos del sistema formado por los tres anillos (fenantridina) y el átomo de nitrógeno cargado positivamente, tienen hibridación sp². Pero no sucede de igual modo con sus grupos sustituyentes.

El grupo fenilo del extremo derecho, los grupos aminos y el grupo etilo enlazado al nitrógeno cargado son responsables de que el sistema absorba las longitudes de onda UV que caracterizan luego la fluorescencia del bromuro de etidio.

Por otro lado, nótese que sus interacciones intermoleculares se rigen principalmente por las atracciones electrostáticas; y en menor grado, se mantienen cohesionadas por las fuerzas dispersivas de London de los anillos.

Propiedades del bromuro de etidio

• Nombre. Bromuro de etidio. Nombre IUPAC: 3,8-Diamino-5-etil-6-fenilfenantridinio bromuro. Sinónimos: bromuro de homidio y Dromilac.
• Fórmula molecular. C₂₁H₂₀N₃Br
• Aspecto físico. Cristales rojo oscuro o se presenta como un polvo marrón.
• Sabor. Amargo.
• Olor. Sólido inodoro.
• Punto de fusión. 260-262 °C (se descompone).
• Punto de ignición. > 100 °C.
• Solubilidad. 40 g /L a 25 °C en agua, y en etanol 2 mg/mL.
• Densidad. 0,34 g / cm³
• Presión de vapor. 1,2·10^-12 mmHg a 25 °C (estimada).
• Coeficiente de partición octanol/agua. Log Kow = – 0,38.
• Descomposición. Cuando se calienta a descomposición el bromuro de etidio emite un humo muy tóxico de bromuro de hidrógeno y óxidos de nitrógeno.
• Estabilidad. Estable e incompatible con los agentes oxidantes fuertes.
• Índice de refracción. 1,67 (estimado).
• pH. 4-7 en una solución al 2% en agua.

Usos del bromuro de etidio

• Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La reacción en cadena de la polimerasa, PCR, permite obtener muchas copias de manera exponencial partiendo de un fragmento de ADN. La técnica se basa en la propiedad de la enzima ADN polimerasa de replicar hebras de ADN a partir de sus fragmentos que le sirven de molde. Es una técnica que tiene infinidad de aplicaciones, entre ellas, la detección de mutaciones relacionadas con enfermedades hereditarias; las pruebas de paternidad; identificación de una persona que cometió un delito, etc. El bromuro de etidio ayuda a la identificación de fragmentos de ADN, productos de su degradación enzimática que puedan ser utilizados en la técnica de PCR.
• Electroforesis de ADN en gel de agarosa y acrilamida. El bromuro de etidio es incorporado al gel previamente a la realización de la electroforesis. El compuesto se intercala entre las bandas del ADN y produce una fluorescencia cuando se expone a la luz ultravioleta que sirve para evidenciar los fragmentos de ADN que se separan en la electroforesis. El patrón de fluorescencia de la electroforesis sirve para una orientación acerca del origen de los fragmentos de ADN. La unión del bromuro de etidio al ADN cambia la conformación, la carga, el peso y la flexibilidad de la molécula de ADN, lo que se traduce en una reducción en la movilidad de la macromolécula. Este efecto aumenta a medida que se incrementa el tamaño del fragmento de ADN.
• Acción del bromuro de etidio sobre los tripanosomas. El bromuro de etidio comenzó a usarse en el tratamiento de la tripanosomiasis del ganado en la década de 1950, con el nombre de Homidio. De allí surgió la denominación de bromuro de homidio como sinónimo del bromuro de etidio. El uso terapéutico del bromuro de etidio se basa en su toxicidad para las mitocondrias. Esto se manifiesta por una reducción del número de copias del ADN mitocondrial. El bromuro de etidio se une a las moléculas de ADN del kinetoplasto del tripanosoma y cambia su conformación a ADNz. Esta forma de ADN es letal, ya que su replicación está inhibida.
• Uso en un modelo de esclerosis múltiple en animales. La inyección directa de bromuro de etidio en la cisterna magna, produjo una lesión de pérdida de mielina aguda reproducible en el tallo cerebral de las ratas. La misma inyección al cordón espinal de los gatos produjo una lesión comparable a la observada en las ratas. La esclerosis múltiple es una enfermedad autoinmune del sistema nervioso, en la cual el sistema inmune produce la destrucción de la mielina, sustancia que recubre las neuronas.

Toxicidad del bromuro de etidio

• Exposición. Se considera un compuesto tóxico, ya que por inhalación provoca una irritación aguda de las vías respiratorias. Asimismo, por contacto con la piel, el bromuro de etidio puede producir inflamación y/o decoloración. Mientras, en los ojos la exposición aguda provoca irritación, enrojecimiento y dolor ocular. Por lo que se recomienda que el material utilizado con el bromuro de etidio sea manejado con la Hoja de Seguridad del Material (MSDS).
• Carácter mutagénico. El bromuro de etidio se tiene como un compuesto altamente mutagénico, ya que al intercalarse en el ADN podría afectar su duplicación y transcripción, provocando mutaciones; e inclusive, se le ha señalado una posible acción carcinogénica. La Prueba de AMES solo detectó la inducción de mutaciones por el bromuro de etidio en bacterias, cuando se utilizó en la prueba un homogeneizado de hígado. Esto hizo pensar que no es responsable directo de la aparición de mutaciones en bacterias, sino que estas podrían ser la consecuencia de la acción de algún metabolito generado en la interacción del bromuro de etidio con el homogeneizado de hígado. Por otro lado, El Natural Toxicology Program estableció que el bromuro de etidio no era mutagénico para las ratas y los ratones. A pesar de esto, su uso está siendo reducido en los laboratorios que lo utilizan en sus investigaciones. No obstante, la concentración de bromuro de etidio usado en las investigaciones es la milésima parte de la concentración de la dosis suministrada al ganado en el tratamiento de la tripanosomiasis, sin el reporte de aparición de mutaciones.

Referencias

1. Doronina, V. Burning bright: a brief history of ethidium bromide DNA staining. Recuperado de bitesizebio.com.
2. Ethidium bromide. Recuperado de en.wikipedia.org.
3. Ethidium bromide. Recuperado de sciencedirect.com.
4. Ethidium bromide. Recuperado de chemspider.com.
5. Procedimiento standard para trabajo con bromuro de etidio. Recuperado de sprl.upv.es.