Agar Sabouraud

¿Qué es el agar Sabouraud?

El agar Sabouraud, o agar dextrosa Sabouraud, es un medio de cultivo sólido, especialmente enriquecido para el aislamiento y desarrollo de hongos, como levaduras, mohos y dermatofitos.

Este medio es necesario para investigar la presencia de hongos patógenos u oportunistas, tanto de muestras clínicas como no clínicas. Es ideal para el crecimiento de bacterias filamentosas como Streptomices y Nocardias. Su uso es muy amplio, pues puede emplearse en la micología humana, animal, vegetal e industrial.

Fue creado en 1896 por el médico Raimond Sabouraud, especialista reconocido mundialmente en desórdenes del cuero cabelludo, principalmente causados por dermatofitos.

Su creación fue tan importante que se emplea desde entonces y se mantiene en la actualidad, aunque con algunas modificaciones.

Aunque es especial para hongos, en este medio pueden crecer bacterias, por eso, para muestras con flora mixta se requiere la inclusión de antibióticos en su preparación para inhibir el crecimiento de la flora bacteriana que pueda estar presente. 

Fundamento

El agar dextrosa Sabouraud es un medio que en su formulación original es débilmente selectivo, debido a su pH ácido, de 5.6 ± 0.2. Sin embargo, las bacterias pueden desarrollarse, principalmente en incubaciones prolongadas.

El medio contiene peptona de caseína y digerido pancreático de tejido animal, que proporcionan la fuente de carbono y nitrógeno para el desarrollo de los microorganismos.

También contiene alta concentración de glucosa, que actúa como fuente de energía, favoreciendo el crecimiento de los hongos por encima de las bacterias. Todo ello mezclado con agar-agar, componente que le brinda la consistencia adecuada.

Al agregársele antibióticos, el agar dextrosa Sabouraud puede ser selectivo. Así, es especialmente útil en muestras de heridas, úlceras abiertas o cualquier muestra en la que se sospeche contaminación bacteriana.

Combinaciones más utilizadas de agar dextrosa Sabouraud con antibióticos

• Agar Sabouraud con cloranfenicol: para recuperar levaduras y hongos filamentosos.
• Con gentamicina y cloranfenicol: en este medio crecen casi todos los hongos filamentosos y levaduras, e inhibe una gran cantidad de bacterias, entre ellas enterobacterias, pseudomonas y Staphylococcus.
• Con cycloheximide: especialmente útil para muestras procedentes de piel o del tracto respiratorio, siempre y cuando la sospecha sea de hongos dimórficos. El cycloheximide debe usarse con precaución: si bien sirve para inhibir el crecimiento de hongos y levaduras no patógenas o ambientales que puedan estar contaminando una muestra, también inhibe el crecimiento de algunos hongos, como Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Allescheria boydii, Penicillium sp. y otros hongos oportunistas.
• Con cloranfenicol más cycloheximide: se usa principalmente para aislar dermatofitos y hongos dimórficos. Tiene el inconveniente de que inhibe algunas especies de hongos oportunistas, como Candida no albicans, Aspergillus, Zigomicetos o C. neoformans.
• Con cloranfenicol, estreptomicina, penicilina G y cycloheximide: ideal para muestras extremadamente contaminadas con bacterias y hongos saprófitos, pero inhibe el crecimiento de Actinomyces y Nocardias, además de los hongos oportunistas mencionados anteriormente.

Preparación

Se puede preparar de la siguiente manera:

Agar dextrosa Sabouraud 

Pesar:

• 40 gr de dextrosa.
• 10 gr de peptona.
• 15 gr de agar-agar.
• Medir 1.000 ml de agua destilada.

Se mezclan todos los ingredientes, se ajusta el pH a 5,6. Se disuelven los solutos mediante ebullición, se distribuyen 20 ml del medio en tubos de 25 x 150 mm, sin reborde y con tapa de algodón preferiblemente.

También se pueden usar otras medidas de tubos, según la disponibilidad. Se llevan al autoclave durante 10 minutos a una atmósfera de presión (121 °C). No se debe exceder en el tiempo de autoclavado. Al salir del autoclave se inclinan los tubos con ayuda de un soporte hasta que solidifiquen en pico de flauta.

Otra forma es disolver los ingredientes por calentamiento hasta que hierva. En la misma fiola autoclavar durante 10 minutos y posteriormente distribuir 20 ml en placas de Petri.

Si se dispone de un medio agar dextrosa Sabouraud que ya contiene todos los ingredientes, se procede a pesar la cantidad que especifique la casa comercial para un litro de agua. El resto de los pasos es igual a los descritos.

Agar dextrosa Sabouraud (modificación de Emmons)

Pesar:

• 20 gr de dextrosa.
• 10 gr de peptona.
• 17 gr de agar-agar.
• Medir 1.000 ml de agua destilada.

Se mezclan todos los ingredientes, se ajusta el pH a 6,9. Proceder de la misma manera del caso anterior.

Hay casas comerciales que ofrecen el medio con todos los ingredientes. En este caso, pesar y preparar del modo como lo describe el inserto.

Agar dextrosa Sabouraud (modificación de Emmons) con cloranfenicol

Solución madre de cloranfenicol

• Pesar 500 mg de cloranfenicol base.
• Medir 100 ml de etanol al 95%.
• Mezclar.

Este medio se prepara como ya fue descrito y adicionalmente, por cada litro de medio, añadir 10 ml de solución madre de cloranfenicol antes de autoclavar.

Agar dextrosa Sabouraud Emmons con cycloheximide

Solución madre de cycloheximide

• Pesar 5 gr de cycloheximide.
• Medir 100 ml de acetona.
• Mezclar.

Se prepara como ya fue descrito y adicionalmente. por cada litro de medio. añadir 10 ml de solución madre de cycloheximide antes de autoclavar.

Agar dextrosa Sabouraud (Emmons) con cloranfenicol y cycloheximide

Se prepara como ya fue descrito y adicionalmente, por cada litro de medio, añadir 10 ml de solución madre de cloranfenicol y 10 ml de solución madre de cycloheximide antes de autoclavar.

Otros antibióticos que pueden ser añadidos

• 20.000 a 60.000 unidades de penicilina por litro de medio.
• 30 mg de estreptomicina por litro de medio.

Ambos deben ser incorporados después de autoclavado el medio, ligeramente enfriado (50-55 °C).

• 0,04 g de neomicina por litro de medio.
• 0.04 g de gentamicina por litro de medio.

Consideraciones especiales

Por seguridad, se prefiere sembrar agar dextrosa Sabouraud en tubos en forma de cuña (inclinado en pico de flauta) antes que en placas de Petri, para evitar la dispersión e inhalación de las esporas.

Es importante que los tubos se tapen con algodón y no con tapa de rosca, ya que se ha demostrado que las condiciones semianaeróbicas inhiben la formación de esporas en algunas cepas, por ejemplo, de Coccidioides immitis. Además, la mayoría de los hongos son aerobios.

En caso de usar tapa de rosca, no cerrar herméticamente.

Control de calidad

A los medios preparados se les debe hacer control de calidad para verificar su buen funcionamiento. Para ello se siembran ciertas cepas controles.

Para agar dextrosa Sabouraud con cloranfenicol se pueden usar cepas ATCC de Candida albicans, el cual debe tener un excelente crecimiento. Otra placa se inocula con cepas de Escherichia coli, debiendo ser inhibido completamente.

También se incuba una placa sin inocular en la que no debe crecer ningún microorganismo.

Para agar dextrosa Sabouraud con cloranfenicol y cycloheximide, se pueden usar cepas de Trichophyton mentagrophytes, debiendo desarrollarse bien. Otra placa se inocula con una cepa de Aspergillus flavus, en el que debe haber crecimiento escaso o no crecimiento. Adicionalmente, se incuba una placa sin inocular para demostrar su esterilidad.

Para agar dextrosa Sabouraud con cycloheximide se usan cepas de Cándida albicans, Trichophyton rubrum o Microsporum canis, los cuales deben demostrar buen crecimiento.

Se incluye una cepa de Aspergillus flavus, demostrando crecimiento escaso o no crecimiento. Finalmente incubar una placa sin inocular para control de esterilidad.

Usos

Cultivo primario

• El agar dextrosa Sabouraud clásico contiene 4 gr de dextrosa y es excelente como medio primario de aislamiento, pues muestra la morfología característica de cada hongo.
• Es excelente para demostrar la producción de pigmentos, aunque no es el más adecuado para observar la esporulación. Tampoco está recomendado para cultivar Blastomyces dermatitidis, inhibido por la alta concentración de glucosa presente.
• Algunos hongos se desarrollan mejor a temperatura ambiente, como los mohos, otros se desarrollan exitosamente a 37 °C, como algunas levaduras, y otros pueden desarrollarse a ambas temperaturas (hongos dimórficos). Por ello, a veces es necesario utilizar varias placas de agar Sabouraud para una misma muestra, pues con frecuencia se realizan sembrados por duplicado para incubar una placa a temperatura ambiente y otra a 37 °C.
• En muestras de micetomas, se siembran dos placas de agar Sabouraud, una con cloranfenicol y otra con cycloheximide. La  primera permitirá el crecimiento de agentes causales de micetoma de origen micótico (Eumicetoma) y la segunda, agentes causales de micetomas de origen bacteriano, como los actinomicetomas.

Esporulación

• El agar dextrosa Sabouraud modificado por Emmons contiene 2 gr de dextrosa y no solo sirve para el aislamiento, sino también para la esporulación y conservación de los hongos. En este medio si se pueden recuperar cepas de Blastomyces dermatitidis.

Conservación

• Para conservar los cultivos de hongos se pueden guardar en nevera (2-8 °C). El tiempo de conservación puede variar de 2 a 8 semanas. Después de este tiempo deben subcultivarse para repetir el proceso.

Microcultivos

• Para la identificación de algunos hongos filamentosos es necesario realizar microcultivos utilizando agar Sabouraud u otros medios especiales para observar las estructuras de reproducción sexual y asexual.

En micología humana

• Es usado principalmente para el diagnóstico de enfermedades micóticas, especialmente aquellas que afectan la piel y sus anexos (pelo y uñas). Las muestras pueden ser secreciones, exudados, piel, pelos, uñas, esputo, LCR u orina. Los patógenos comúnmente aislados son dermatofitos, hongos causantes de micosis subcutáneas y sistémicas.

Micología animal

• Los animales con frecuencia son afectados por infecciones micóticas, por tanto, el agar Sabouraud es muy útil en la micología animal para reconocer los microorganismos que afectan a los animales. 

Micología ambiental

• Muchos hongos patógenos u oportunistas pueden concentrarse en un momento dado en un ambiente determinado, especialmente en quirófanos y Unidades de Cuidados Intensivos (UCI) de clínicas y hospitales. Por tanto es necesario realizar un control de los mismos.
• Otros espacios vulnerables son las bibliotecas y edificios viejos, que pueden verse afectados por la concentración de hongos ambientales.
• En estudios de ambiente se utiliza el agar dextrosa Sabouraud para el aislamiento de los hongos.

Micología industrial

• Es útil para el estudio de hongos contaminantes en la producción de cosméticos, alimentos, bebidas, cueros, textiles, entre otros.

Micología vegetal

• Las plantas también sufren enfermedades causadas por hongos, afectando diferentes partes de la planta, que incluso pueden acabar con la cosecha, provocando grandes pérdidas en la agricultura.

Referencias

1. Agar Sabouraud dextrosa con cycloheximida. Recuperado de andinamedica.com.
2. Navarro O. Micología veterinaria. Universidad Nacional Agraria. Nicaragua.