¿Qué es el caldo tetrationato?
El caldo tetrationato o caldo TT, es un medio de cultivo líquido selectivo para el enriquecimiento y recuperación de cepas del género Salmonella. Fue creado por Müeller y más tarde modificado por Kauffmann, por ello hay quienes le llaman caldo Müeller-Kauffmann.
El medio original contenía proteosa peptonas, carbonato de calcio y tiosulfato de sodio. Kauffmann le adicionó sales biliares y creó aparte otra modalidad con verde brillante. Estas sustancias inhiben el crecimiento de coliformes, dejando el medio libre para el desarrollo de las bacterias patógenas, en este caso, Salmonella.
La modificación fue muy acertada porque aumentó significativamente la sensibilidad del medio. Por ello, actualmente es útil para la búsqueda de Salmonellas en cualquier tipo de muestra, pero en especial para heces sólidas o líquidas y alimentos.
Su preparación consta de dos fases: el medio comercial es una base para preparar el caldo tetrationato, y posteriormente para que el tetrationato se pueda formar se agrega una solución de iodo iodurada que completa el medio.
La American Public Health Association (APHA) recomienda el uso del caldo tetrationato suplementado con verde brillante para el enriquecimiento de muestras en busca de Salmonella, ya que es más selectivo que el caldo tetrationato y el caldo selenito.
En general, el caldo tetrationato es ideal cuando se sospecha la presencia de bacterias del género Salmonella en pequeñas cantidades o que se encuentren maltratadas por la exposición a sustancias inhibidoras o por procesos industriales que minimicen su viabilidad.
Fundamento
Las peptonas presentes corresponden a digeridos pancreático de caseína y digerido péptico de tejido animal. Estas proporcionan la fuente de carbono, nitrógeno y nutrientes en general para el crecimiento bacteriano.
Por su parte, el tiosulfato de sodio reacciona con la solución iodurada para formar tetrationato. Este inhibe el crecimiento de coliformes y favorece el desarrollo de bacterias que contienen la enzima tetrationato reductasa, entre ellas se encuentra el género Salmonella, pero también Proteus.
Las sales biliares también actúan como sustancia inhibidora de la mayoría de las bacterias grampositivas y algunas gramnegativas (coliformes).
El carbonato de calcio absorbe las sustancias tóxicas generadas por la descomposición del tetrationato, lo cual forma ácido sulfúrico. En este sentido, el carbonato de calcio neutraliza la acidez manteniendo el pH del medio estable.
En el caso de la modalidad con verde brillante, esta sustancia aumenta el poder selectivo del caldo tetrationato al inhibir otros microorganismos distintos al género Salmonella.
Preparación
Caldo tetrationato
Solución iodo iodurada
Pesar:
- 6 g de iodo.
- 5 g de ioduro de potasio.
El ioduro de potasio se disuelve en aproximadamente 5 ml de agua destilada estéril, luego se le agrega el iodo poco a poco mientras se calienta la mezcla. Después que esté completamente disuelto, se enrasa con agua destilada estéril hasta llegar a un volumen final de 20 ml.
Medio base para caldo tetrationato
Pesar 46 gramos del medio deshidratado y suspender en 1 litro de agua destilada estéril. Mezclar y calentar hasta su disolución total, puede llevar a ebullición solo por pocos minutos. No esterilizar en autoclave. La base del medio se deja enfriar hasta 45 °C aproximadamente y en ese momento se le agrega 20 ml de la solución iodurada.
Después de agregar la solución iodurada al medio debe utilizarse inmediatamente. Si no se desea usar toda la mezcla, se debe proceder de la siguiente manera:
Se distribuye 10 ml del medio base en tubos, y solo a los que van a ser inoculados con muestras se le agrega 0,2 ml de la solución iodurada.
Los que no se van a utilizar todavía se pueden guardar en nevera, sin embargo, como el medio no está esterilizado, lo ideal es preparar la cantidad exacta que se necesita.
El color del medio antes de agregar la solución de iodo iodurada es blanco lechoso con precipitado blanco y después de agregado es color marrón con un precipitado denso. El precipitado observado es normal y corresponde al carbonato de calcio que no se disuelve. El pH final del medio es de 8,4 ± 0,2.
Variante caldo tetrationato con verde brillante
Para preparar el caldo tetrationato con verde brillante se realizan todos los pasos descritos anteriormente, pero adicionalmente se va a agregar a la mezcla 10 ml de la solución verde brillante preparada al 0,1%.
Verde brillante
Esta solución se prepara de la siguiente manera:
Pesar 0,1 g de verde brillante y suspender en 100 ml de agua destilada. Calentar hasta ebullición para lograr su disolución total. Guardar en frasco ámbar.
Uso
Para muestras de heces (coprocultivo) el protocolo es el siguiente:
- Inocular 1 g de heces sólidas o 1 ml de heces líquidas en un tubo con 10 ml de caldo tetrationato listo para usar. Agitar fuertemente e incubar en aerobiosis a 43 °C por 6-24 horas.
- Subsiguientemente, tomar una alícuota de 10 a 20 µl del caldo y subcultivar en un medio selectivo para Salmonella, tales como agar SS, agar XLD, agar verde brillante, agar entérico Hektoen, entre otros.
- Paralelamente, se deben inocular medios selectivos para Salmonella con la muestra directa (heces) sin enriquecimiento. Para muestras de hisopados rectales, descargar el material recolectado en el tubo y proceder de la forma descrita anteriormente.
- Para muestras de alimentos, pesar 10 g del alimento sólido o 10 ml del alimento líquido e inocular un frasco con 100 ml de caldo tetrationato listo para usar. Proceder de igual manera que la descrita anteriormente pero incubar a 37 °C.
Como puede observarse, la relación entre la muestra y el caldo siempre será de 1:10.
Control de calidad
Para probar el medio de cultivo se pueden emplear cepas controles conocidas. Las más utilizadas son las cepas certificadas ATCC.
Las cepas a utilizar son Salmonella typhimurium ATCC 14028, Salmonella abony DSM 4224, Salmonella enteritidis ATCC 13076, Escherichia coli ATCC 25922, Enterococcus faecalis ATCC 19433 y Staphylococcus aureus ATCC 25923.
Para las cepas de Salmonella se espera un desarrollo excelente, en tanto que Escherichia coli puede tener un desarrollo débil o regular, y las cepas grampositivas (Enterococcus y Staphylococcus) se inhiben parcial o totalmente.
Recomendaciones
- Como este medio no inhibe el crecimiento de Proteus, algunos laboratorios acostumbran colocar 40 mg/L de novobiocina para evitar el desarrollo de esta cepa microbiana. El antibiótico se debe agregar antes de la solución de iodo iodurada.
- Después de preparado el medio, incluyendo la solución de iodo iodurada, no debe pasar más de 2 horas en ser inoculado.
- Al momento de distribuir el medio en los tubos se debe homogeneizar la mezcla continuamente para resuspender el precipitado formado.
- En muestras menos contaminadas se incuba el caldo tetrationato a 35-37 °C, y en muestras muy contaminadas se recomienda la incubación a 43 °C.
Referencias
- Medios BBL. Preparados en tubo para el cultivo de la especie Salmonella.
- Forbes, B., Sahm, D., Weissfeld, A. Diagnóstico Microbiológico de Bailey & Scott. Editorial Panamericana S.A. Argentina.