¿Qué es el DAPI?
El DAPI (4’, 6-diamidino-2-fenilindol) es un colorante fluorescente que tiñe núcleos celulares y ADN, siendo muy utilizado en microscopía de fluorescencia o citometría de flujo, entre otras. La fluorescencia que emite es azul brillante, su excitación se produce entre 455-461 nm (luz UV).
El colorante DAPI puede atravesar la membrana celular de las células muertas con gran facilidad. También puede teñir los núcleos de células vivas, pero en este caso, la concentración debe ser mayor.
El DAPI es capaz de acceder al ADN celular por el que tiene una especial afinidad, uniéndose a las bases nitrogenadas adenina y timina. Por este motivo es de gran utilidad en algunas técnicas de biología molecular.
Este compuesto pertenece al grupo de los colorantes indólicos, y ha demostrado tener mayor sensibilidad por el ADN que el bromuro de etidio y el yoduro de propidio, especialmente sobre geles de agarosa.
El uso de este colorante fluorescente es muy amplio, pues es útil para estudiar cambios en el ADN en los procesos apoptóticos (muerte celular) y, por tanto, detectar células en este proceso; para la foto footprinting de ADN (impresión fotográfica del ADN); estudiar la contaminación bacteriana o visualizar la segmentación nuclear.
También se ha utilizado en el estudio de bandas cromosómicas, en la detección de ADN de Mycoplasma sp, en la interacción ADN-proteína, en la tinción y contaje de células por inmunofluorescencia e inclusive para colorear granos maduros de polen.
Características del DAPI
– Nombre y fórmula. DAPI es la abreviación de su nombre químico (4’, 6-diamidino-2-fenilindol). Su fórmula molecular es C16H15N5.
– Peso molecular. 350,3.
– Rango de luz. Cerca del rango de luz UV (345 a 358 nm) ocurre la excitación máxima del complejo DAPI-ADN, mientras que la emisión de fluorescencia máxima ocurre entre 455-461 nm.
– Aspecto físico. Polvo de color amarillo, pero las estructuras marcadas con este fluoróforo emiten una luz azul brillante.
– Afinidad por el ADN. Se une preferentemente a las regiones ricas en adenina (A) y timina (T) del ADN.
– Permeabilidad celular. Penetra membranas celulares en células fijadas y permeabilizadas. En células vivas, su entrada es más limitada, pero puede usarse con concentraciones altas o permeabilizadores.
– Compatibilidad con otras tinciones. Se puede usar con otros colorantes fluorescentes sin interferencias significativas. Es compatible con técnicas como inmunofluorescencia y microscopía de fluorescencia.
– Seguridad y precauciones. Se considera mutagénico potencial, por lo que se recomienda usar guantes y gafas de protección al manipularlo. Evitar la exposición prolongada a la luz, ya que puede degradarse con el tiempo.
Fundamento del DAPI
Esta coloración se fundamenta en generar una contratinción nuclear en las principales técnicas de biología molecular, como citometría de flujo, microscopía de fluorescencia y tinción de cromosomas metafásicos o núcleos interfásicos, entre otras.
Esta técnica se basa en la gran afinidad que tiene el colorante por las bases nitrogenadas (adenina y timina) contenidas en el material genético (ADN) en el surco menor. Mientras que a nivel citoplasmático deja muy poco fondo.
Cuando ocurre la unión del colorante fluorescente a las regiones de adenina y timina del ADN, la fluorescencia aumenta significativamente (20 veces más). El color que emite es azul brillante. Cabe destacar que no hay emisión de fluorescencia cuando se une a los pares de bases GC (guanina-citosina).
Es importante resaltar que aunque también tiene afinidad por el ARN, esta no causa problema, debido a que el mayor grado de emisión de energía de esta molécula ocurre a otra longitud de onda (500 nm), a diferencia del ADN, que lo hace a 460 nm. Además, el aumento de fluorescencia una vez unido al ARN es de solo 20%.
El DAPI se usa más para teñir células muertas (fijadas) que vivas, ya que para colorear estas últimas se necesita una concentración mucho más alta del colorante, porque la membrana celular es mucho menos permeable al DAPI cuando está viva.
El colorante DAPI se puede usar en combinación con fluoróforos rojos y verdes para obtener una experiencia multicolor.
Usos del DAPI
El DAPI (4’, 6-diamidino-2-fenilindol) es un excelente fluoróforo y, por tanto, es ampliamente utilizado en diversas técnicas y para diversos propósitos.
- Citometría de flujo. Los investigadores Gohde, Schumann y Zante en 1978 fueron los primeros en utilizar y proponer el DAPI como fluoróforo en la técnica de citometría de flujo, teniendo un gran éxito debido a su alta sensibilidad por el ADN y su alta intensidad en la emisión de fluorescencia. El uso de DAPI en esta técnica permite el estudio del ciclo celular, la cuantificación de células y la tinción de células vivas y muertas. Aunque existen otros colorantes, como el bromuro de etidio, el óxido de Hoechst, el naranja de la acridina y el yoduro de propidio, el DAPI es uno de los más utilizados por ser más fotoestable que los anteriormente mencionados. Para esta técnica se requiere fijar las células, para ello puede usarse etanol absoluto o paraformaldehído al 4%. La muestra se centrifuga y se desecha el sobrenadante, posteriormente se hidratan las células adicionando 5 ml de solución amortiguadora PBS por 15 minutos. Mientras transcurre el tiempo, preparar el colorante DAPI con un tampón de tinción (FOXP3 de BioLegend) a una concentración de 3 µM. Centrifugar la muestra, desechar el sobrenadante y posteriormente cubrir con 1 ml de solución DAPI por 15 minutos a temperatura ambiente. Llevar la muestra al citómetro de flujo con el láser adecuado.
- Microfluorometría de flujo. Otra técnica donde se utiliza el DAPI es en la micro-fluorometría de flujo junto con otro fluoróforo llamado mitramicina. Ambos son útiles para cuantificar el ADN de cloroplasto de forma individual, pero DAPI es el más indicado para medir partículas de bacteriófagos T4.
- Hibridación in situ. Esta técnica básicamente utiliza sondas de ADN marcadas con un colorante fluorescente, que puede ser el DAPI. La muestra requiere ser tratada con calor para desnaturalizar el ADN bicatenario y convertirla en dos cadenas monocatenarias. Posteriormente, se hibrida con una sonda de ADN desnaturalizado marcado con DAPI, que posee una secuencia de interés. Posteriormente, se lava para eliminar lo que no se hibridó, se utiliza un contraste para visualizar el ADN. El microscopio de fluorescencia permite la observación de la sonda hibridada. Esta técnica tiene la finalidad de detectar secuencias específicas en el ADN cromosómico, pudiendo hacer el diagnóstico de determinadas enfermedades. Estas técnicas cito-moleculares han sido de gran ayuda para determinar detalles en el estudio de los cariotipos. Por ejemplo, ha evidenciado las regiones ricas en pares de bases de adenosina y timina denominadas regiones heterocromáticas o bandas DAPI. Esta técnica también se usa mucho para el estudio de cromosomas y cromatina en plantas y animales, así como en el diagnóstico de patologías prenatales y hematológicas en el humano. En esta técnica, la concentración de DAPI recomendada es de 150 ng/ml por un tiempo de 15 minutos. Los portaobjetos ya montados deben guardarse protegidos de la luz a 2-8 °C.
- Tinción de inmunofluorescencia. Las células se fijan con paraformaldehído al 4%. Si se van a utilizar otros colorantes, se deja el DAPI al final como contratinción y se cubren las células con solución PBS por 15 minutos. Mientras transcurre el tiempo, preparar la solución DAPI diluyendo con PBS, de tal manera que la concentración final sea 300 µM. Luego se extrae el PBS sobrante y se cubre con DAPI por 5 minutos. Se lava varias veces. La lámina se observa en un microscopio de fluorescencia bajo el filtro adecuado.
Hoja de seguridad para el DAPI
Este compuesto debe ser manipulado con cuidado, debido a que es un compuesto con propiedades mutagénicas. El carbón activado es utilizado para eliminar este compuesto de soluciones acuosas que van a ser descartadas.
Deben utilizarse guantes, bata y lentes de seguridad para evitar accidentes con este reactivo. Si ocurre contacto con piel o mucosas, se debe lavar el área con suficiente agua.
Jamás hay que pipetear este reactivo con la boca, se deben utilizar propipetas. Tampoco contaminar el reactivo con agentes microbianos, ya que ello se traducirá en resultados erróneos.
No diluir el colorante DAPI más de lo recomendado, porque disminuirá considerablemente la calidad de la tinción.
No exponer el reactivo a la luz directa, ni conservar en calor porque ello disminuye la fluorescencia.
Referencias
- Brammer, S., Toniazzo, C., Poersch, L. Corantes comúnmente empregados na citogenética vegetal.Arq. Inst. Biol. Recuperado de scielo.org.
- DAPI. Recuperado de menarinidiagnostics.com.
- Instructions for use of DAPI. Recuperado de cytocell.com.
- Elosegi, A., Sabater, S. Conceptos y técnicas en ecología fluvial. Recuperado de books.google.co.ve.
- Rojas-Martínez, R., Zavaleta-Mejía, E., Rivas-Valencia, P. Presencia de fitoplasmas en papayo (Carica papaya) en México. Revista Chapingo. Serie horticultura. Recuperado de scielo.org.