¿Qué es el agar TCBS?
El agar TCBS es un medio de cultivo sólido altamente selectivo y diferencial, utilizado para el aislamiento y cultivo de bacterias del género Vibrio, especialmente Vibrio cholerae, V. vulnificus y V. parahaemolyticus como principales patógenos de este género.
Las siglas TCBS significan Tiosulfato Citrato Bilis Sacarosa. A este agar también se le conoce con el nombre de medio selectivo para Vibrio. La fórmula original fue creada por Nakanishi y posteriormente modificada por Kobayashi.
Está compuesto por extracto de levaduras, peptona de carne, tripteína, citrato de sodio, tiosulfato de sodio, bilis de buey, sacarosa, cloruro de sodio, citrato férrico, azul de bromotimol, azul de timol y agar.
Esta composición permite un adecuado desarrollo de las especies de Vibrio a partir de muestras de aguas, alimentos y heces; a excepción de Vibrio hollisae, que no crece en este medio. Además, el medio TCBS es capaz de inhibir el crecimiento de otras bacterias acompañantes, en especial coliformes.
Debido a los graves problemas gastrointestinales y extra-intestinales que producen algunas especies del género Vibrio, su diagnóstico es muy importante. El humano se infecta principalmente por el consumo de alimentos crudos o poco cocidos del mar o aguas contaminadas, pero también a través de la infección de heridas.
Debido a ello, los laboratorios clínicos deben incluir el agar TCBS en el estudio de coprocultivos de muestras de heces líquidas, especialmente con aspecto de agua de arroz. Sobre todo si el paciente refiere haber estado en contacto con agua de mar o haber consumido mariscos o pescados.
Fundamento
El extracto de levaduras, las peptonas de carne, y la tripteína son la fuente nutritiva de este medio. Sin embargo, el agar TCBS es un medio inhóspito para la mayoría de las bacterias.
Su alta selectividad viene dada por el agregado de citrato de sodio y bilis de buey. Ambos son agentes inhibidores que además proporcionan un pH alcalino al medio, restringiendo el crecimiento de la flora acompañante y favoreciendo el crecimiento de V. cholerae, entre otras especies. Cabe destacar que Vibrio cholerae es muy sensible a la acidez.
Por su parte, el cloruro de sodio equilibra osmóticamente al medio. Además, como su concentración es alta, también actúa como un agente inhibidor, favoreciendo el crecimiento de bacterias halófilas.
La sacarosa es el azúcar fermentable que, junto a los indicadores de pH azul de bromotimol y azul de timol, le dan el carácter diferencial al medio. Por tal motivo, con este medio es posible diferenciar las cepas fermentadoras de sacarosa de las no fermentadoras.
Las colonias de las cepas fermentadoras de sacarosa se desarrollan de color amarillo y harán virar el medio de verde a amarillo por la producción de ácidos. Las no fermentadoras crecen translúcidas y el medio queda del color original (verde).
Asimismo, este medio contiene tiosulfato de sodio, como fuente de azufre, y citrato férrico, como agente revelador. Ambos evidencian las bacterias capaces de producir sulfuro de hidrógeno (gas incoloro). El H2S se forma a partir del tiosulfato y posteriormente, al reaccionar con el citrato férrico, se forma un precipitado negro visible.
Finalmente, el agar es el que proporciona la consistencia sólida al medio.
Preparación
Pesar 89 g del medio deshidratado y disolver en un litro de agua destilada. Ayudar la disolución por calentamiento y agitación frecuente. La mezcla puede dejarse hervir hasta por 2 minutos.
Este medio no se autoclava. Después de su disolución, se sirve directamente sobre placas estériles. Al solidificar se ordenan de forma invertida en plaqueros y se guardan en nevera (2-8 °C) hasta su uso.
El medio después de preparado debe quedar a pH 8,6 ± 0,2.
El color del medio deshidratado es de color beige claro o beige-verdoso, y el color del medio es verde bosque o verde azulado.
Es importante dejar atemperar las placas antes de sembrar las muestras.
Usos
- La muestra más común para el aislamiento de Vibrios son las heces diarreicas. Si las muestras de heces no pueden ser sembradas inmediatamente en el medio selectivo, deben trasportarse en el medio de Cary Blair.
- Para aumentar la sensibilidad del cultivo, las heces pueden pasarse por agua peptonada a pH 8,4 como medio de enriquecimiento durante 8 horas máximo, de allí se subcultiva al medio TCBS.
- También hay que tener en cuenta que algunas cepas de Vibrio pueden causar septicemias en pacientes inmunosuprimidos, por tanto, pueden aislarse de hemocultivos.
- Asimismo, pueden analizarse muestras de aguas y alimentos provenientes del mar, cuando existen brotes epidémicos de la enfermedad del cólera.
Sembrado
El inóculo de la muestra en estudio debe ser prominente, el sembrado se realiza por el método de estriamiento por agotamiento. Las placas se incuban a 37 °C por 24 horas en aerobiosis.
Las colonias presuntivas de Vibrio cholerae son de tamaño mediano, lisas, opacas, de bordes delgados y de color amarillo debido a que fermentan la sacarosa.
De forma similar crecen las especies de V. alginolyticus, V. fluvialis, V. hareyi, V. cincinnatiensis, V. furnissii, V. metschnikovii y algunos V. vulnificus. Otras especies de Vibrio clínicamente importantes, como V. parahaemolyticus, no fermentan la sacarosa, desarrollándose como colonias verde oliva.
Por otra parte, hay que tener presente que algunas cepas de Aeromonas y Plesiomonas que son oxidasa (+) pueden crecer en este medio, desarrollando colonias amarillas que pueden confundir al clínico. Mientras que algunas cepas de Pseudomonas también oxidasa (+) crecen como colonias verdes, al igual que V. parahaemolyticus.
Limitación
La prueba de la oxidasa que es positiva para el género Vibrio jamás deberá realizarse a partir de colonias obtenidas del agar TCBS, pues el resultado será un falso negativo. Los compuestos del medio interfieren fuertemente en esta prueba. Por tanto, debe efectuarse a partir de subcultivos en agar sangre.
Control de calidad
Para probar que el medio está en buenas condiciones, es recomendable sembrar cepas controles conocidas o certificadas, y observar si el crecimiento cumple con las características esperadas.
Para ello se pueden utilizar cepas de:
- Vibrio cholerae: crecimiento satisfactorio (colonias amarillas, borde translúcido).
- Vibrio parahaemolyticus: crecimiento satisfactorio (colonia con centro verde y borde translúcido).
- Vibrio alginolyticus ATCC 17749: crecimiento satisfactorio (colonias amarillas con halos del mismo color alrededor de la colonia).
- Enterococcus faecalis ATCC 29212: inhibición total o parcial (colonias pequeñas, amarillas o translúcidas).
- Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853: inhibición parcial o total (colonias azules).
- Escherichia coli ATCC 25922: inhibido completamente.
- Proteus mirabilis ATCC 43071: inhibición total o parcial (pequeñas colonias centro verde, borde translúcido).
La incubación de un medio sin inocular no debe tener cambio.
Referencias
- TCBS Agar. Recuperado de bd.com.
- TCBS Medio. Recuperado de britanialab.com.