¿Qué es la actividad enzimática?
La actividad enzimática es una manera de expresar la cantidad de la enzima presente en un momento determinado. Indica la cantidad de sustrato transformado en producto, por la acción catalítica de la enzima por unidad de tiempo.
Está influenciada por las condiciones en que tiene lugar la reacción enzimática, razón por la cual se suele referir a la temperatura a la cual se mide. Para entender mejor el concepto, hay que saber qué son las enzimas. Las enzimas son catalizadores biológicos, capaces de acelerar la velocidad de una reacción sin experimentar un cambio irreversible durante el proceso catalizado.
En general, son proteínas, con la excepción de los ribosomas, moléculas de ARN con actividad enzimática. Las enzimas incrementan la velocidad de la reacción mediante la reducción de la barrera energética (energía de activación), que debe vencerse para alcanzarse el estado de transición y ocurra la reacción.
Las moléculas del sustrato que alcanzan el estado de transición experimentan cambios estructurales, que hacen que originen las moléculas del producto. Según las funciones que cumplen, se clasifican en seis grandes grupos: oxirreductasas, transferasas, hidrolasas, liasas, isomerasas y ligasas.
Las enzimas bromelina y papaína, por ejemplo, son enzimas proteolíticas (hidrolasas) que se encuentran en la piña y en la papaya, respectivamente.
Se sabe que la piña y la papaya facilitan el proceso digestivo, pues cuando actúan las enzimas proteolíticas que contienen, ayudan a digerir las proteínas provenientes de los alimentos, como carnes y granos.
Unidad de la actividad enzimática
La unidad enzimática (UI) es la cantidad de enzima que cataliza la transformación de 1 µmol de sustrato en un minuto.
Posteriormente, el Sistema Internacional de Unidades (SI) definió la unidad de actividad enzimática como la cantidad de enzima que convierte 1 mol de sustrato en producto por segundo. Esta unidad recibió el nombre de katal (kat).
1 mol = 106 µmoles y 1 minuto = 60 segundos.
Por lo tanto, 1 katal equivale a 60·106 UI. Como el katal es una unidad grande, se suelen utilizar unidades menores, como el microkatal (µkat), 10-6 katal, y el nanokatal (πkat), 10-9 katal.
Actividad específica
Es el número de las unidades de actividad enzimática dividido entre los miligramos de proteína de la muestra sometida a ensayo. La actividad específica está relacionada directamente con el grado de purificación de la enzima.
¿Cómo se mide la actividad enzimática?
Hay varios métodos para determinar la actividad de una enzima. La elección de un método en particular dependerá del objetivo del ensayo enzimático, la aplicabilidad del método, el acceso al equipo necesario para realizar el experimento, el costo de la utilización de un método determinado, etc.
Existen métodos espectrofométricos, fluorométricos, de quimioluminiscencia, calorimétricos, radiométricos y cromatográficos.
Los métodos espectrofotométricos pueden ser colorimétricos y lecturas en la región de la luz ultravioleta (UV) de la radiación electromagnética.
Método colorimétrico
Se basa en la generación de un cromóforo por la acción enzimática. La actividad enzimática puede seguirse en forma continua o discontinua.
Forma continua
Se colocan los reactivos en una cubeta en el espectrofotómetro a la longitud de onda deseada, la cual corresponde a la que el cromóforo tiene su máximo valor de densidad óptica, y que además, no haya interferencia con otra sustancia que pueda generarse.
La reacción enzimática se inicia por la adición de la muestra que contiene la enzima cuya actividad se desea determinar. Se pone a funcionar el cronómetro, y a cada cierto tiempo, se anota el valor de densidad óptica.
Como se conoce la equivalencia de la densidad óptica con los moles de sustrato o del producto de la acción enzimática, dependiendo de la técnica utilizada, se pueden calcular los moles del sustrato consumidos o de los moles producidos.
Además, como se ha medido el tiempo transcurrido de la reacción enzimática, se pueden obtener los moles consumidos o producidos por segundo. Así, la actividad enzimática se establece en unidades katal.
Forma discontinua
Se colocan los tubos de ensayo con los componentes de la reacción, a excepción de la muestra que contiene la enzima u otro componente, en un baño a 37 ºC. La reacción se inicia con la adición del componente faltante.
Se deja que ocurra el tiempo que la técnica indica, y la reacción finaliza por la adición de un compuesto que la detiene. Se lee la densidad óptica en ese momento, y se procede de la misma forma anterior para determinar la actividad enzimática.
Método de lecturas en la luz ultravioleta
La coenzima nicotinamidadinucleótido, por ejemplo, tiene dos formas: NADH (reducida), y NAD+ (oxidada). Asimismo, la coenzima nicotinamidadinucleótidofosfato tiene dos formas NADPH y NADP+, reducida y oxidada, respectivamente.
Tanto las formas reducidas como oxidadas de la coenzima se leen a una longitud de 260 nm de la luz ultravioleta, y solo las formas reducidas se leen a una longitud de 340 nm de la luz ultravioleta.
Por ello, tanto las reacciones de oxidación o reducción en las que intervienen las coenzimas nombradas, se leen a 340 nm.
La determinación de la actividad enzimática, en esencia, es el mismo método seguido en la forma continua del método colorimétrico, salvo que se lee la densidad óptica a 340 nm para observar la generación de NADH o NADPH, o para medir el consumo de estas coenzimas.
Esto dependerá de si la reacción medida es de oxidación o de reducción. Mediante la correspondencia entre la densidad óptica y los moles de NADH y NADPH, según sea el caso, se puede calcular la actividad enzimática dividiendo los moles de la coenzima entre el tiempo transcurrido en segundos.
Regulación de la actividad enzimática
Control del sustrato o del producto
A medida que aumenta la concentración del sustrato, aumenta la actividad enzimática. Pero a una concentración determinada del sustrato, se satura el sitio activo o los sitios activos de la enzima, por lo que la actividad enzimática se hace constante.
No obstante, el producto de la acción enzimática también puede interaccionar con los sitios activos de la enzima, produciendo una inhibición de la actividad enzimática.
El producto puede actuar como un inhibidor competitivo. Por ejemplo, puede mencionarse la enzima hexoquinasa. Esta enzima produce la fosforilación de la glucosa originando la glucosa-6-fosfato, compuesto que al acumularse inhibe a la hexoquinasa (ver imagen).
Control por retroacción
Puede ocurrir que un grupo de enzimas (A, B, C, D, E y F) actúen en forma secuencial en una vía metabólica. La enzima B usa como sustrato el producto de la enzima A, y así sucesivamente.
La célula, dependiendo de sus requerimientos metabólicos, puede activar o inhibir las secuencias de actividades enzimáticas. Por ejemplo, la acumulación del producto de la enzima F, puede actuar inhibiendo la enzima A o cualquier otra de las enzimas de la secuencia.
Enzimas alostéricas
Una enzima puede estar formada por varias subunidades, cada una con sus respectivos sitios activos. Pero estas subunidades no actúan independientemente, por lo que la actividad de una de las subunidades puede activar o inhibir la acción de las restantes.
Aunque la hemoglobina no se considera una enzima, es un modelo perfecto del fenómeno de alosterismo. La hemoglobina está formada por cuatro cadenas proteicas, dos cadenas α y dos cadenas β, cada una de ellas unidas a un grupo hemo.
Entre las subunidades pueden ocurrir dos fenómenos: homoalosterismo y heteroalosterismo.
Homoalosterismo
La unión del sustrato a una de las subunidades aumenta la afinidad de las otras subunidades por el sustrato, aumentando a su vez la actividad enzimática de cada una de las subunidades restantes. Asimismo, la inhibición de la actividad enzimática en una de las subunidades, produce el mismo efecto en las restantes.
En el caso de la hemoglobina, la unión del oxígeno a un grupo hemo de una de las cadenas de la proteína genera un aumento de la avidez por el oxígeno en las restantes cadenas.
Asimismo, la liberación del oxígeno de un grupo hemo, genera la liberación de oxígeno de los restantes grupos de las cadenas proteicas.
Heterolosterismo
La unión de una sustancia activadora o inhibidora, distinta del sustrato, a una de las subunidades provoca una activación o inhibición de la actividad enzimática en las otras subunidades.
En el caso de la hemoglobina, la unión al grupo hemo de H+, CO2 y 2,3-difosfoglicerato a una de las subunidades, disminuye la afinidad del grupo hemo por el oxígeno, provocando su liberación. Esta liberación de oxígeno también es producida en las demás cadenas de la hemoglobina.
Factores que influyen en la actividad enzimática
Concentración del sustrato
A medida que aumenta la concentración del sustrato, aumenta también la actividad enzimática. Esto se debe a un mayor acceso de las moléculas del sustrato a los sitios activos de la enzima.
Pero, para una concentración determinada del sustrato, se saturan de este todos los sitios activos de la enzima, provocando que la actividad enzimática no aumente, aun si se incrementa la concentración del sustrato.
pH de la reacción enzimática
Las enzimas tienen un pH óptimo en el cual la afinidad de la enzima por el sustrato es máxima. A este pH se alcanza el máximo valor de la actividad enzimática.
El exceso de acidez o basicidad del medio, puede generar una desnaturalización de la enzima, disminuyendo su actividad.
El perfil de pH de la actividad enzimática es variado. Así, por ejemplo, la pepsina tiene una actividad máxima entre 1-2 unidades de pH, la tripsina tiene un pH óptimo de 8, y la papaína tiene una actividad constante en un pH entre 4 y 8.
Temperatura de la reacción enzimática
La actividad enzimática se incrementa a medida que aumenta la temperatura. En general, la actividad enzimática se duplica por cada 10 grados de incremento, hasta alcanzar la temperatura óptima de la actividad enzimática.
Sin embargo, al superar la temperatura óptima, la actividad enzimática tiende a disminuir a medida que se incrementa la temperatura de la reacción. Esto es porque las proteínas, y por ende las enzimas, sufren una desnaturalización por un aumento excesivo de la temperatura.
Concentración iónica de la reacción
En general, las enzimas tienen una actividad óptima en una gama de concentración comprendida entre 0 y 500 mmoles/L. Sin embargo, para concentraciones mayores, la actividad enzimática tiende a disminuir.
Bajo estas circunstancias, se bloquean ciertas interacciones iónicas en las enzimas, necesarias para su máxima actividad.
Referencias
- Segel, I. H. Biochemical Calculations (2nd Edition). John Wiley & Sons, INC.
- Lehninger, A. L. Biochemistry (2nd Edition). Worth Publishers, inc.
- Mathews, C. K., van Holde, K. E. y Ahern, K. G. Bioquímica (3ra Edición). Pearson Addison Weshley.
- Enzyme assay. Recuperado de en.wikipedia.org.
- González, J.M. Cinética enzimática. Recuperado de ehu.eus.