¿Qué es el microscopio de campo oscuro?
El microscopio de campo oscuro es un instrumento óptico especial utilizado en ciertos laboratorios. Es el resultado de una modificación realizada a la microscopía de campo claro. La microscopía de campo oscuro se puede lograr por trans-iluminación o por epi-iluminación.
La primera se fundamenta en bloquear los rayos de luz que llegan al condensador de forma directa, a través de dispositivos que se interponen antes de que los rayos de luz lleguen al condensador.
El campo oscuro con luz transmitida permite resaltar las estructuras, pudiéndose observar partículas extremadamente delgadas. Las estructuras se observan con cierta refringencia o brillo en un fondo oscuro.
Por su parte, el efecto de epi-iluminación se logra con luz incidente u oblicua. En este caso, el microscopio debe estar equipado con un filtro especial en forma de media luna.
Con la iluminación incidente las estructuras observadas presentan un efecto visual en alto relieve. Esta propiedad permite destacar los bordes de las partículas en suspensión.
A diferencia de la microscopía de campo claro, la de campo oscuro es especialmente útil para la visualización de preparaciones al fresco que contienen partículas en suspensión, sin ningún tipo de coloración.
Sin embargo, tiene varias desventajas, entre ellas que no puede utilizarse para preparaciones en seco o teñidas. No tiene buena resolución. Además, para asegurar una buena imagen, la apertura numérica de los objetivos no puede superar a la del condensador.
Características del microscopio de campo oscuro
- Modificaciones. La composición del microscopio de campo oscuro presenta modificaciones importantes con respecto al de campo claro, pues los fundamentos de ambas microscopías son opuestas.
- Iluminación especial. Utiliza un sistema de iluminación especial. En lugar de iluminar directamente la muestra desde la parte inferior, la luz se desplaza desde un ángulo oblicuo. Esto crea un fondo oscuro alrededor de la muestra.
- Resalta estructuras transparentes. Es especialmente útil para visualizar estructuras transparentes o incoloras, no fácilmente visibles con técnicas de iluminación convencionales.
- Contraste mejorado. Al eliminar la luz directa que incide sobre la muestra, se produce un contraste mejorado entre la muestra y su entorno, lo que facilita observar detalles finos y pequeñas estructuras.
- Aplicaciones específicas. Se emplea con frecuencia para observar células vivas, bacterias, microorganismos y otras muestras biológicas. También es útil para observar partículas pequeñas, como polvo o cristales.
- No requiere tinción. A diferencia de otros tipos de microscopios, que requieren que las muestras sean teñidas para mejorar el contraste, el de campo oscuro puede visualizar muestras no teñidas.
Partes del microscopio de campo oscuro
Sistema mecánico
- Tubo. Dispositivo por donde viaja la imagen reflejada y aumentada por el objetivo hasta llegar al ocular u oculares.
- Revólver. Soporte donde se ubican los distintos objetivos. Los objetivos no están fijos, pueden removerse. El revólver puede rotar de tal manera que se puede cambiar de objetivo cuando el operador así lo necesite.
- Tornillo macro. Se utiliza para enfocar la muestra, se mueve hacia adelante o hacia atrás para acercar o alejar la muestra del objetivo y el movimiento es grotesco.
- Tornillo micrométrico. Se mueve hacia adelante o hacia atrás para acercar o alejar la muestra del objetivo. Se utiliza para movimientos muy finos o delicados, casi imperceptibles. Es el que logra el enfoque definitivo.
- Platina. Soporte donde reposará el espécimen sobre el portaobjetos. Posee una abertura central por donde pasan los haces de luz. Cuando se mueven los tornillos macro y micrométrico la platina sube o baja, dependiendo del movimiento del tornillo.
- El carro. Permite que se pueda recorrer con el objetivo toda la muestra. Los movimientos permitidos son adelante y atrás y viceversa, y de izquierda a derecha y viceversa.
- Pinzas sujetadoras. Están sobre la platina, son de metal y tienen como función sujetar el portaobjeto para evitar que se ruede durante su observación. Es importante que la muestra se mantenga fija mientras se observa. Los sujetadores tienen la medida exacta para recibir al portaobjeto.
- Brazo o asa. Une el tubo con la base. Es el lugar por donde debe agarrarse el microscopio cuando se va a trasladar de un lado a otro. Con una mano se toma el brazo y con la otra se sujeta la base.
- Base o pie. Es la base o soporte del microscopio. Gracias a ella el microscopio es capaz de mantenerse fijo y estable sobre una superficie plana.
Sistema óptico
- Objetivos. Tienen forma cilíndrica. Poseen una lente en la parte inferior que aumenta la imagen que proviene de la muestra. Los objetivos pueden ser de diversos aumentos. Ejemplo: 4,5X (lupa), 10X, 40X y 100X (objetivo de inmersión). El objetivo de inmersión se denomina así porque necesita de la colocación de unas gotas de aceite entre el objetivo y la muestra. Los demás se llaman objetivos secos. Los objetivos traen impresas las características que poseen. Ejemplo: la marca del fabricante, la corrección de curvatura de campo, la corrección de aberración, el aumento, la apertura numérica, las propiedades ópticas especiales, medio de inmersión, longitud del tubo, distancia focal, grosor del cubreobjeto y anillo de código de color. Los objetivos poseen un lente frontal ubicado en la parte inferior y un lente posterior ubicado en la parte superior.
- Oculares. Los microscopios viejos son monoculares, es decir, poseen un solo ocular, y los modernos son binoculares, es decir, tienen dos oculares. Los oculares tienen forma cilíndrica y hueca. Estos poseen en su interior lentes convergentes que amplían la imagen virtual creada por el objetivo. El ocular se une con el tubo. Este último permite que la imagen transmitida por el objetivo llegue al ocular, que la aumentará nuevamente. El ocular, en su parte superior, contiene un lente denominado ocular y en su parte inferior, un lente llamado colector. También posee un diafragma, y dependiendo de dónde se ubique, tendrá un nombre. Los que se ubican entre ambas lentes se denominan ocular de Huygens y si se ubica después de las 2 lentes se llama ocular de Ramsden. Aunque existen muchos otros. El aumento del ocular oscila entre 5X, 10X, 15X o 20X, dependiendo del microscopio. Es a través del ocular u oculares que el operador puede visualizar la muestra. Algunos modelos traen un anillo movible en el ocular izquierdo y permite el ajuste de la imagen. Este anillo ajustable se denomina anillo de dioptrías.
Sistema de iluminación
- Lámpara. Es la fuente de iluminación y se ubica en la parte inferior del microscopio. La luz es halógena y se emite de abajo hacia arriba. Por lo general, la lámpara que poseen los microscopios es de 12 V.
- Diafragma. Carece de iris. En este caso, impide que los rayos que provienen de la lámpara lleguen de forma directa a la muestra, solo los haces oblicuos tocarán el espécimen. Aquellos haces dispersados por las estructuras presentes en la muestra son los que pasarán al objetivo. Esto explica por qué las estructuras se ven brillantes y luminosas en un campo oscuro.
- Condensador. Este condensador es distinto al de campo claro. Existen dos tipos: los condensadores de refracción y los condensadores de reflexión. Este último a su vez se divide en dos categorías: los paraboloides y los cardioides.
- Condensadores de refracción. Posee un disco que se interpone para refractar los rayos de luz, puede ubicarse encima del lente frontal o en el lado posterior. Es muy fácil de improvisar un condensador de este tipo, pues basta con colocar al frente del lente frontal del condensador un disco elaborado en cartulina negra de un tamaño inferior al lente (diafragma). Un microscopio óptico de campo claro puede convertirse en un microscopio de campo oscuro utilizando este consejo.
- Condensadores de reflexión. Son los que utilizan los microscopios estereoscopios. Los hay de dos tipos: paraboloides y cardioides. Paraboloides: poseen un tipo de curvatura denominada paraboloides por su similitud a una parábola. Este tipo de condensador es ampliamente usado en el estudio de sífilis, ya que permite observar a los Treponemas. Cardioides: la curvatura del condensador es de forma similar a un corazón, de allí el nombre, “cardioide”, llevando el condensador el mismo nombre. Posee un diafragma regulable.
Usos del microscopio de campo oscuro
- Es utilizado para investigar la presencia de Treponema pallidum en muestras clínicas.
- También es útil para observar Borrelias y Leptospiras.
- Es ideal para observar el comportamiento in vivo de células o microorganismos, siempre y cuando no sea preciso detallar estructuras específicas.
- Ideal para resaltar la cápsula o la pared de los microorganismos.
Ventajas y desventajas del microscopio de campo oscuro
Ventajas
- Son más económicos los microscopios de campo oscuro con condensador de refracción.
- Su uso es muy útil en aumentos de 40X.
- Son ideales para observar muestras que posean un índice de refracción similar al medio donde se encuentran. Por ejemplo, células en cultivo, levaduras o bacterias móviles como las espiroquetas (Borrelias, Leptospiras y Treponemas).
- Se puede observar la célula in vivo, lo que permite evaluar su comportamiento. Por ejemplo, movimiento browniano, movimiento por flagelos, movimiento por emisión de pseudópodos, proceso de división mitótica, eclosión de larvas, gemaciones de levaduras, fagocitosis, entre otros.
- Permite resaltar los bordes de las estructuras, por ejemplo, la cápsula y la pared celular.
- Es posible analizar partículas disgregadas.
- No se necesita tinción.
Desventajas
- Se debe tener especial cuidado al montar las preparaciones, ya que si quedan muy gruesas no se observará bien.
- Baja resolución de las imágenes.
- Los microscopios de campo oscuro que utilizan condensadores de refracción presentan un porcentaje de luminosidad muy bajo.
- Reducción de la apertura numérica. Para mejorar la calidad de la imagen con objetivo de inmersión (100X) es necesario que se reduzca la apertura numérica de los objetivos y así aumentar la del cono iluminador. Para ello es indispensable la incorporación de un diafragma adicional que pueda regular la apertura numérica del objetivo.
- No se pueden visualizar preparaciones al seco, ni preparaciones coloreadas, a menos que sean colorantes vitales.
- No permite la visualización de ciertas estructuras, especialmente las internas.
- Los microscopios de campo oscuro son más costosos.
Referencias
- Microscopio de campo oscuro. Recuperado de es.wikipedia.org.
- Agudelo, P., Restrepo, M., Moreno, N. Diagnóstico de leptospirosis de muestras de sangre y cultivo por observación en microscopio de campo oscuro. Biomédicas. Recuperado de scielo.org.
- Rodríguez, F. Tipos de Microscopios ópticos. Recuperado de franrzmn.com.
- Dark-field microscopy. Recuperado de en.wikipedia.org.
- Bhatia, M., Umapathy, B., Navaneeth, B. An evaluation of dark field microscopy, culture and commercial serological kits in the diagnosis of leptospirosis. Indian J Med Microbiol. Recuperado de nlm.nih.gov.